Новый набор плазмид упростит генетическую модификацию метилотрофных дрожжей

Система CRISPR-Cas9 адаптирована для геномного редактирования множества разных организмов, однако существующие подходы к генетической модификации довольно трудоемки и часто низкоэффективны. В частности, такая проблема существовала и в случае метилотрофных дрожжей, широко используемых для производства ценных в фармакологии и пищевой промышленности белков. Сотрудники ФИЦ Биотехнологии РАН с коллегами разработали набор плазмид, доставляющих в клетки гены компонентов CRISPR-Cas9 в виде отдельных молекул ДНК, которые объединяются в одну генетическую конструкцию прямо в дрожжах. Это позволило значительно упростить процедуру геномного редактирования и достичь высокой эффективности введения CRISPR-Cas9 в дрожжевые клетки. Результаты работы опубликованы на страницах International Journal of Molecular Sciences. Исследование выполнено в рамках проекта Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий и поддержана национальным проектом «Наука и университеты».

Дрожжи с давних пор используются человеком, например, в виноделии и при приготовлении хлеба. Они также стали одним из важнейших объектов биотехнологии. В частности, так называемые метилотрофные дрожжи родов Ogataea и Komagataella оказались чрезвычайно востребованы для наработки белков, используемых в фармакологии и пищевой промышленности. При этом «заставить» дрожжи производить не свойственные им, но нужные человеку молекулы, можно, «вставив» интересующий ген в геном этих микроскопических грибов. Еще более широкие возможности открывает технология редактирования генома CRISPR-Cas9, которая позволяет значительно перестроить метаболизм клеток.

CRISPR-Cas9 представляет собой систему бактериального иммунитета, поскольку с ее помощью микроорганизмы «запоминают» чужеродные ДНК и РНК, например, принадлежавшие вирусам, которые пытались когда-либо проникнуть в клетку. Принцип «запоминания» заключается в том, что белки Cas, с одной стороны, просто уничтожают чужеродные последовательности, чтобы предотвратить заражение, а с другой вырезают из генома патогена фрагменты, которые затем встраиваются в CRISPR-кассету — по сути, коллекцию генетических участков всех тех интервентов, с которыми столкнулась бактерия. Далее с CRISPR-кассеты синтезируются молекулы РНК, которые вместе с белком Cas9 «патрулируют» клетку и ищут уже знакомые генетические последовательности «врагов».

Ученые адаптировали CRISPR-Cas9 систему для того, чтобы встраивать с ее помощью чужеродные, но зачастую ценные с точки зрения биотехнологии гены не только в клетки бактерий, но и дрожжей, растений и даже животных. Таким образом уже удается создавать устойчивые к болезням сорта сельскохозяйственных культур и улучшенные породы животных, а также лечить (пока не массово) тяжелые заболевания людей, например серповидноклеточную анемию и β-талассемию. Однако существующие подходы геномного редактирования, в том числе и для клеток дрожжей, довольно трудоемки и неудобны в использовании.

Сотрудники ФИЦ Биотехнологии РАН (Москва) вместе с коллегами из Курчатовского института (Москва) предложили подход, который значительно упростит процесс редактирования генома при помощи системы CRISPR-Cas9 у метилотрофных дрожжей. За основу авторы взяли две искусственные плазмиды — кольцевые молекулы ДНК, — одна из которых несла ген, кодирующий белок Cas9, а вторая — короткую РНК, распознающую место в геноме, которое нужно «отредактировать». Кроме того, в последовательности включили бактериальные гены, обеспечивающие устойчивость к антибиотику генетицину. Эти гены служили своеобразным маркером, с помощью которого можно было точно выявить те дрожжевые клетки, в которых вставка плазмид произошла успешно. Так, если дрожжи оказывались способны расти на среде с антибиотиком, значит, в них также присутствовала система CRISPR-Cas9.

Исследователи одновременно ввели в клетки дрожжей две вышеописанные плазмиды, предварительно разрезав особым образом — так, чтобы они смогли «найти» друг друга в клетке и соединиться концевыми участками в единую последовательность. Образовавшаяся в результате единая плазмида поддерживалась в клетках дрожжей автономно, то есть без внедрения в хромосому. После того, как доставленная таким образом система CRISPR-Cas9 выполнила свою функцию по редактированию генов, плазмида удалялась. Авторы продемонстрировали эффективность предложенного подхода, успешно отредактировав геномы четырех видов метилотрофных дрожжей: Ogataea polymorpha, O. parapolymorpha, O. haglerorum и Komagataella phaffii.

«Потенциально наша система может использоваться для изменения одновременно нескольких генов, однако это нам еще предстоит проверить в новых экспериментах. Вместе с тем, уже сейчас у нас есть хороший инструмент для редактирования геномов метилотрофных дрожжей, что расширяет возможности их использования для создания штаммов-продуцентов рекомбинантных белков и применения к ним методов метаболической инженерии», — рассказывает один из авторов исследования, Михаил Агафонов, д.б.н., руководитель группы генной инженерии низших эукариот ФИЦ Биотехнологии РАН.