Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — реакция, используемая в молекулярной биологии для того, чтобы размножить (амплифицировать) нужный фрагмент ДНК (или РНК). Часто бывает так, что ДНК получают в очень низких для «прочтения» последовательностей концентрациях, либо нужно отсеквенировать только какой-то небольшой участок, окруженный множеством других, поэтому молекулярные биологи часто используют ПЦР. Кроме того, эта реакция позволяет сращивать фрагменты ДНК и вводить мутации.
Избирательное копирование нужного фрагмента проводится в пробирке (in vitro) с помощью фермента, устойчивого к относительно высоким температурам. Этот фермент называется ДНК-полимеразой (поэтому реакция полимеразная, а так как ДНК — это молекула-цепочка, то она также цепная). Суть действия этого фермента заключается в построении новой нити ДНК по шаблону комплементарной (парной) ей. Однако в отличие от копирования ДНК в живой клетке ПЦР, как уже было сказано выше, копирует многократно один и тот же участок.
Из-за того что ДНК-полимераза достраивает цепочки не с нуля, а только с 3'-конца (гидроксильной группы) уже имеющейся цепи, ей для синтеза нужна небольшая затравка — кусочек цепи ДНК, за 3'-конец которой можно зацепиться на старте. У клетки есть свой механизм решения этой проблемы, а для лабораторной ПЦР ученым нужно этот кусочек синтезировать. Называется он праймером, имеет длину в 18-30 нуклеотидов и комплементарен началу нужного участка, то есть его нуклеотиды парны нужным и должны с ними соединиться.
ПЦР проходит обычно в 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурации ДНК (разворачивание молекулы под действием высокой, 90-96°C, температуры), отжига праймеров (их прикрепление к цепи при понижении температуры до 60-72°C) и элонгации (буквально — «удлинение»; достраивание копий от праймера).
Поскольку для денатурации, разворачивания и разъединения цепей ДНК, нужна высокая температура, а циклов в ходе ПЦР нужно много, полимераза должна быть устойчивой к высокой температуре, чтобы не приходилось снова и снова добавлять этот фермент в каждом цикле после денатурации, ведь в норме ДНК-полимераза в клетке работает при гораздо меньшей температуре и такие воздействия разрушают ее.
Найти подходящий фермент удалось не сразу: если идею ПЦР предложил еще норвежец Хьелль Клеппе в начале 1970-х годов, то реализовать ее смог только Кэри Муллис в 1983 году, а публикация в Science появилась только в 1985 году (позже за открытие этой реакции он получил Нобелевскую премию). В 1986 году он улучшил метод, предложив использовать полимеразу термофильных бактерий или архей, которые живут в горячих источниках и «привыкли» копировать свою ДНК при высоких температурах.
Подходящие полимеразы были выделены, и даже несколько: Taq (из бактерий Thermus aquaticus), Pfu и Pwo (из разных архей). Первая имеет недостаток в точности копирования, но две других работают гораздо медленнее, поэтому Taq-полимераза используется сейчас в смеси с Pfu. Кэри Муллис и компания «Цетус» запатентовали полимеразу, а затем права на патент выкупила компания Хофман-Ла-Рош. Далее выяснилось, что она была описана советскими учеными: биохимиками А. Калединым, А. Слюсаренко и С. Городецким — еще в 1980 году, а еще четырьмя годами ранее — американцами Элис Чьен, Дэвидом Эдгаром и Джоном Трела. В связи с этим от компании Рош даже требовали отказаться от прав на фермент в судебном порядке, и история противостояний завершилась в 2005 году, когда срок патента истек.
Фото: Silodam/Wikimedia Commons