Игра в мутацию: генетические головоломки

Судоку, «Игра в имитацию», пицца, робот-сортировщик и транспозоны — настоящие пути науки удивительнее всех мыслимых и немыслимых выдумок. Следуя этими путями, биологи создают генетические карты и легенды к ним, разбираясь, за что отвечает каждый ген.

Исследователи из Принстона и Гарварда придумали, как создать инструмент для более быстрого и дешевого выяснения функций генов. Отчет о работе появился в научном журнале Nature Communications.

Зачем гены отправляют в нокаут

«Мы понятия не имеем, что делают довольно большие группы генов», — признается Баз Барстоу, соавтор статьи и стипендиат исследовательского фонда Burroughs-Wellcome на химическом факультете Принстонского университета. Даже если геном организма расшифрован и прочитан, это не значит, что загадок в нем не осталось. Можно выяснить, в каком месте находится ген, представить, какой белок он кодирует, но понять, что этот белок делает в организме, используя лишь расчеты, практически невозможно.

Как же это делают? Чтобы ответить на этот вопрос, представьте себе ситуацию: в одной комнате вы видите бескрайние ряды выключателей, а в другой горит огромное множество лампочек. Провода скрыты в стене. Лучший способ понять, с какой лампочкой соединен выключатель, — выключить его и посмотреть, какая погаснет. То же самое делают и с генами. Горящие лампочки — это фенотипические признаки, которые мы наблюдаем у организма, а выключатели — это геном. Чтобы понять, за что отвечает ген, проще всего «выключить» его и посмотреть на результат. По-английски это намеренное блокирование работы гена называется «knocking-out», то есть «нокаутирование».

Но чтобы узнать функции большого количества генов, необходимы огромные затраты времени и средств — годы и миллионы долларов. Из-за этого генетические карты с полностью расшифрованными функциями каждого гена существуют только для небольшого числа изученных вдоль и поперек модельных организмов, таких как пекарские дрожжи или бактерия Escherichia coli (кишечная палочка), хотя огромная информативность и полезность таких нокаутных коллекций не подлежит сомнению. С момента их публикации к ним обратились тысячи исследовательских групп.

Даже пицца не помогла

Ученые из Принстонского и Гарвардского университетов нашли способ устанавливать функции каждого из генов быстро и доступно. Теперь на это потребуется всего несколько тысяч долларов, а займет весь процесс меньше месяца. Новая технология получила название «нокаутное судоку» (Knockout Sudoku) в честь одноименной головоломки.

Основана эта методика на случайном нокаутировании генов и мощном алгоритме, помогающем «заполнять пропущенные клетки» в геномной головоломке. Ни одна из исследовательских групп, пытавшихся ранее использовать тот же подход, не смогли даже приблизиться к тем показателям стоимости и скорости, которые будут доступны научному сообществу благодаря Knockout Sudoku. «Мы надеемся, что генетика наконец выйдет за пределы изучения модельных организмов», — говорит Майкл Баум, соавтор работы из Гарвардской медицинской школы.

Исследование началось с огромной кучи квитанций на пиццу и транспозонного мутагенеза. Этот способ позволяет вставлять одну последовательность ДНК в случайный ген, блокируя его работу. Однако для этого требуется множество мутантных копий, чтобы можно было быть уверенным, что каждый ген выключен хотя бы в одной из них. Ученые начали с колонии в 40 000 бактерий Shewanella oneidensis, которая имеет около 3600 генов. Для ручной сортировки мутантов и расселения их по разным лункам Барстоу нанял студентов, труд которых он обещал оплачивать пиццей. После целого дня работы результаты были неутешительны: отсортировали лишь несколько тысяч бактерий.

В итоге было решено арендовать робота-сортировщика. Всего за два дня он распределил всех мутантов по 417 отдельным лункам на 96-луночных планшетах. Но настоящим испытанием было прочтение геномов всех мутантных вариантов, чтобы их можно было внести в общий список, идентифицировав функцию каждого нокаутированного гена. Для этого ДНК каждого мутантного варианта обычно амплифицируют («размножают») и затем секвенируют (читают ее последовательность). Эту сложную и трудоемкую часть работы генетики предложили упростить, особым образом сгруппировав разнообразных мутантов, в результате чего понадобилось читать не 417 геномов, а 61, что почти в 7 раз меньше.

«Многоклеточные» головоломки проверили на геномах одноклеточных

Но даже результаты всего этого долгого процесса ученые получают в виде громадного вороха данных, который нужно обработать, чтобы понять, от мутантов из какой лунки получены сиквенсы (прочитанные геномные последовательности). Чтобы справиться с этой задачей, исследователи создали алгоритм, который, как человек, разгадывающий судоку, мог определить планшет, столбец и строку лунки, откуда появился мутантный вариант. Существовала еще одна проблема. Поскольку мутации были вызваны спонтанно встраивающимся в геном транспозоном, они могли случайно повторяться. Чтобы найти решение, Барстоу даже пересмотрел «Игру в имитацию» — фильм о том, как Алан Тьюринг разгадывал код немецкой шифровальной машины «Энигма». По его мнению, работа была действительно сродни взлому кода. «Например, в английском языке буква "a" используется с частотой 8,2%. Следовательно, если вы встречаете неизвестную букву, которая появляется с частотой 8,2%, вы можете предположить, что искомая буква — "a"». Этот простой статистический вывод, называемый также байесовским (в честь английского математика и священника Томаса Байеса, жившего в XVIII веке), и стал ключом к разгадке «нокаутного судоку».

Авторы работы подчеркивают, что математические методы, положенные в основу технологии, позволяют получать гораздо больше результатов из меньшего числа экспериментов. Им же самим этот метод помог разобраться в работе генов бактерии Shewanella oneidensis, которые известны своей способностью передавать электроны, являются потенциальными источниками не вредящей природе электроэнергии и могут быть использованы в искусственном фотосинтезе (о котором можно подробнее прочитать в обзоре Indicator.Ru: часть 1 и часть 2) и для нейтрализации ядерных отходов. При использовании старых методов на это понадобилось бы около 15 лет исследований.

Точность результатов поначалу была довольно низкой. Перепроверив математические расчеты и не найдя там ошибок, ученые обратились к планшетам и лункам. Оказалось, проблема была в том, что кто-то из ассистентов поместил туда один неправильный образец. Исследователи выдохнули с облегчением: самой ненадежной частью их технологии оказался человек.