Лохматые белки связываются с токсинами

Белка вы или белок — в любом случае вам (или вашему носителю) вряд ли доставит много удовольствия взаимодействие с токсинами. Для белки токсин — это отравление и смерть, а для белка он сулит неожиданные «встречи», нарушение работы и иногда — изучение с помощью системы CRISPR. Как повысить «лохматость» белков и для чего используются «нокаутированные» мыши, рассказывает Indicator.Ru

Учёным из США удалось установить, на что воздействует токсин бактерии клостридии, которая незаметно живёт в «резервациях» нашего кишечника, но после подавления бактериальной микрофлоры антибиотиками может «совершить государственный переворот» в свою пользу, резко размножиться, как сорняки на случайно образовавшейся «проплешине» газона, и вызвать тяжёлое заболевание кишечника — энтероколит. Indicator.Ru объясняет значение работы, которая была опубликована в Nature, а также рассказывает о технологии CRISPR/Cas и одном из важнейших путей, определяющих клеточную судьбу.

Что общего у нас и «лохматых» дрозофил

Если вы, читая заголовок, во втором слове поставили ударение на первый слог, выбор сделан неверно: речь пойдёт не о пушистых зверьках, а о дрозофилах, кишечной палочке, «нокаутированных» мышах и бактерии, вызывающей энтероколит. Но не стоит сильно себя корить: даже название Института белка РАН, расположенного в городе Пущино Московской области (в стенах которого тоже изучают пресловутые белки Frizzled, в буквальном переводе — «лохматые» белки), однажды перевели как Squirrel Institute. Это название некоторое время даже находилось на официальном сайте.

Сами белки семейства Frizzled впервые были найдены у мушки-дрозофилы и получили своё название благодаря способности делать так, чтобы у подопытных мушек «лохматость повысилась». Но волосатые дрозофилы не самый впечатляющий результат их работы в организме. Белки этого семейства представлены очень широко и встречаются почти у всех видов, составляющих животное царство: от примитивных фильтраторов-губок до человека, способного эти белки изучать.

Frizzled — белки-рецепторы, а значит, они должны связываться со специфическими молекулами. В нормальных условиях, когда рядом нет бактериального токсина, Frizzled связывается с белками сигнального каскада Wnt. Эта цепочка реакций соединяет в единую сеть последовательность молекул, через которые информация от клеточного рецептора передаётся внутри клетки. Название Wnt складывается из двух компонентов: Wg — wingless — в честь мутации, подавляющей развитие крыльев у дрозофил, и Int — гена позвоночных, родственного гену развития мушиных крыльев. После открытия двух первых генов были найдены и другие их «родственники» (например, представителей семейства Wnt у человека около двух десятков). Этот сигнальный каскад работает как стрелочник, переключающий стрелки на железной дороге поездам-клеткам и определяющий их дальнейшую судьбу.

Заткнись и не переключай

У cреднестатистической клетки человеческого тела, как и у нас самих, есть особенные поворотные моменты в жизни. Важнейшие из них — самоопределение и «профориентация» каждой клетки в процессе развития эмбриона, когда из одной оплодотворённой яйцеклетки, а затем — из кучки одинаковых клеток-клонов развивается полноценный организм, среди триллионов клеток которого каждая находится на своём месте, выглядит определённым образом и выполняет собственную функцию. В образовании и продуктивном сосуществовании всего этого многообразия клеток — от безъядерного двояковогнутого эритроцита до клеток ресничного эпителия, от нейронов до клеток сердечной мышцы — велика заслуга Wnt-каскада, который направил каждую клетку основать колонию потомков особенного типа и построить ткани и органы.

Иногда клетки могут взбунтоваться или из-за поломки Wnt-каскада получить указание жить не по правилам и, например, начать активно делиться, когда эмбриональный период давно прошёл. Если такие нарушения не заметить вовремя и не казнить виновных, клетки, сошедшие с прямого пути правильной генетической программы на скользкую дорожку опасных импровизаций, начинают быстро мутировать. В результате их оплот анархии и сепаратизма обрастает автономной инфраструктурой — сетью собственных кровеносных сосудов — и перестаёт считаться с нуждами всего организма, превращаясь в раковую опухоль. Неслучайно учёные, открывшие первые белки Wnt, сначала считали их маркерами раковых заболеваний и только потом поняли, в чём заключается их функция в здоровых клетках.

Теперь становится ясно, как важен сигнальный путь Wnt и его взаимодействие с белками Frizzled. Неудивительно, что связывание этих рецепторов с другим веществом, которое «затыкает» «лохматый» рецептор и мешает ему присоединять белки Wnt (по-научному это называется конкурентное ингибирование), приносит организму множество проблем.

«Переведи меня через мембран»

Одна из таких проблем — псевдомембранозный колит, характеризующийся повышением температуры, диареей, увеличением толстой кишки и способный привести к летальному исходу при отсутствии своевременного лечения. Только в США ежегодно регистрируется полмиллиона случаев заболевания и 29 000 вызванных им смертей. О механизме и причинах заболевания было известно лишь то, что два токсина, которые вырабатывает бактерия Clostridium difficile, возбудитель колита, проникают в клетку с помощью рецепторов. Токсины «притворяются» чем-то полезным, демонстрируя рецепторам часть, похожую на то, с чем они обычно связываются, и заставляя клетку заглатывать их. Затем эти токсины инактивируют маленькие ферменты ГТФ-азы — белки, отрезающие часть молекулы ГТФ для получения клеткой энергии, освобождающейся при разрыве химической связи. Теряя источник энергии, клетки эпителия толстой кишки сжимаются, становятся круглыми и погибают.

Американские учёные в сотрудничестве с немецким Институтом токсикологии провели широкомасштабные поиски последовательностей в геноме, которые могли бы кодировать тот самый рецептор. Отдельно искали виновника, который связывается с самим токсином, и отдельно — с его участком, с которым он должен взаимодействовать по предположениям учёных.

Исследователи выяснили, что один из двух гомологичных токсинов клостридии запускает все эти разрушительные для организма процессы при конкурентном ингибировании рецепторов Frizzled, который и предоставляет токсинам право входа в клетку.

Кроме того, в ходе исследования был найден ещё один рецептор, который может пропускать вероломные молекулы, CSPG4, однако его нет у клеток эпителия толстой кишки, поэтому его вклад в заболевание косвенный.

CRISPR и современная ДНК-хирургия

Поиск проводился с помощью системы CRISPR/Cas-9. Эта система, открытая в 80-х годах прошлого века у бактерий, оказалась удобным скальпелем для разрезания ДНК в строго определённых местах. У бактерий CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) используется как аналог нашего иммунитета: они умеют хранить данные о вирусных атаках прошлого в «картотеке», чтобы распознать и уничтожить врага, когда он появится снова.

Вместо отпечатков пальцев и фоторобота вирусов бактерии оставляют в своём геноме кусочки их ДНК, перемежая их короткими повторяющимися последовательностями. Узнавать эти последовательности помогает специальный белок Cas-9. Если вместо РНК, синтезированной с участка ДНК вируса, которая хранится между повторами, поставить участок, который нужен исследователям, Cas-9 будет находить и разрезать его в геноме. РНК, которая на своём примере учит белок Cas-9 искать нужные ДНК, называется «гидом».

Клеткам линии HeLa (опухолевые клетки Генриетты Лакс, которые в ходе мутаций приобрели способность делиться неограниченное количество раз, что делает их удобной моделью для опытов), которые стабильно производили белок Cas-9, были введены последовательности, кодирующие более 19 тысяч типов РНК-«гидов», нацеленных на разные гены. Затем эти клетки обрабатывали бактериальным токсином, а потом смотрели, какой ген учили разрезать РНК-«гиды» выживших клеток.

Как уже было отмечено выше, этими генами оказались те, что кодируют рецепторы CSPG4 и Frizzled. Затем учёные проверили, работает ли та же закономерность в модели «мини-кишечника» — культуры клеток толстого кишечника в условиях, приближенных к условиям их реального существования.

После этого рецепторы с честью выдержали проверку и на мышах, которым отключение (нокаутирование) кодирующих их генов помогало спастись от действия токсина. Правда, блокирование столь важных рецепторов убивало мышей ещё на стадии эмбриона или вызывало пороки развития, поэтому такой подход помог подтвердить участие рецепторов в связывании с токсинами, а не найти лекарство. Но эта работа, установившая причины нарушения, поможет в разработке методов лечения псевдомембранозного колита в дальнейшем.