Ученые с помощью мутаций увеличили стабильность белков-«светофоров»
Российские ученые получили стабильный и яркий флуоресцентный белок moxSAASoti, способный менять окраску и интенсивность собственного свечения. Для этого авторы точечно изменили последовательность кодирующего его гена. Ранее все белки, способные «переключать» цвет, были очень чувствительны к окислению и переставали светиться, тогда как новый вариант молекулы не теряет своих свойств. Результаты исследования, поддержанного грантом Российского научного фонда (РНФ), опубликованы в журнале Scientific Reports.
Флуоресцентные белки представляют собой молекулы, которые при облучении светом определенных длин волн способны сами светиться. Ученые выделяют их из живых организмов, например медуз и кораллов, или искусственно синтезируют в лабораториях. На сегодняшний день существует множество флуоресцентных белков, различающихся по цвету и интенсивности излучения, а также по вариантам изменения окраски. Так, некоторые из них просто переходят из флуоресцентного состояния в нефлуоресцентное, то есть перестают светиться, а другие способны менять цвет излучения с зеленого на красный. Этот процесс протекает, когда белок облучают светом определенной длины волны. Он может быть обратимым и необратимым. Некоторые флуоресцентные белки способны изменять цвет свечения только один раз, что происходит в результате разрыва химических связей. В этом случае структура вещества полностью нарушается и не восстанавливается самостоятельно. Однако есть исключения, например белок SAASoti, который способен многократно изменять интенсивность своего свечения (включаться-выключаться) и переходить из зеленой формы в красную. Однако SAASoti имеет недостаток — он очень чувствителен к окислителям, которые нарушают его структуру. Например, он окисляется даже на воздухе, что объясняется высокой фотохимической активностью входящих в его состав аминокислотных остатков цистеина.
Ученые из Института биохимии имени А. Н. Баха ФИЦ биотехнологии РАН (Москва) и Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова (Москва) с помощью мутаций в гене SAASoti создали варианты флуоресцентного белка с минимальным содержанием цистеина и даже вовсе не несущие его. Для этого авторы получили ДНК с нужными заменами и затем ввели ее в клетки кишечной палочки E. сoli. Таким образом микроорганизмы получили ген, кодирующий белок SAASoti, и синтезировали на его основе белки, отличающиеся от исходных по строению: в них последовательность аминокислот, которую можно сравнить с очень длинным словом, изменялась на одну, две или большее количество букв. Однако выяснилось, что белки совсем без цистеина остались чувствительными к окислителям, как и исходные варианты. Каждая из вводимых мутаций (замен одной буквы на другую) приводила к интересному изменению свойств белка. Так, например, одиночные точечные мутации вызвали его обесцвечивание, а в результате двухточечного мутагенеза был получен ряд белков с различной степенью яркости окраски. При этом исследователи с помощью математического моделирования могли предварительно предсказать влияние конкретной мутации на свойства белка.
В результате экспериментов было выявлено, что самые благоприятные положения для мутаций — 105 и 117 аминокислота. Соответствующие белки очистили и сравнили между собой по интенсивности окраски, скорости ее изменения, устойчивости к факторам окружающей среды и по другим физико-химическим свойствам. Так, при длине света 520 нанометров наиболее ярким оказался вариант, содержащий в 117 положении аминокислоту треонин, — белок moxSAASoti-T. Кроме того, он в восемь раз быстрее, чем другие варианты, менял цвет.
«Полученный нами флуоресцентный белок moxSAASoti-T имеет уникальные нехарактерные для других белков свойства, такие как высокая устойчивость к окислителям, быстрое и обратимое изменение интенсивности свечения и окраски. Он может быть использован в современной микроскопии, например в области нейробиологии, для изучения поведения белков в различных условиях среды. Бифотохромные свойства, то есть способность изменять цвет свечения, делают moxSAASoti-T интересным объектом для дальнейших исследований», — рассказывает руководитель проекта по гранту РНФ Александр Савицкий, доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией физической биохимии Института биохимии имени А. Н. Баха ФИЦ биотехнологии РАН.