Найден способ повысить точность разрезания ДНК

Ученые из МГУ, Сколтеха и ИТЭБ РАН изучили механизм действия одного из ферментов, который разрезает ДНК, и предложили механизм, позволяющий контролировать его активность. Их разработки весьма перспективны для технологии редактирования генома. Результаты этого исследования были опубликованы в журнале PLoS ONE.

Редактирование генома — одно из наиболее многообещающих направлений биотехнологии и молекулярной медицины будущего. Манипуляции с ДНК ученые осуществляют с помощью бактериальных ферментов. Эти ферменты «узнают» в последовательности ДНК определенный участок и в этом месте с хирургической точностью разрезают ДНК. Одна из самых востребованных технологий редактирования генома на сегодняшний момент — CRISPR/Cas. Однако у этого метода есть существенный недостаток – при его использовании возникает множество незапланированных и непредсказуемых мутаций. Одной из причин этих мутаций является то, что геномный редактор этой системы, белок Cas9, разрезает обе цепи в спирали ДНК, после чего фрагменты ДНК могут перестраиваться случайным образом. Эти мутации не обязательно сразу приводят к каким-либо серьезным последствиям для клетки и организма, но чего ожидать от них впоследствии — неизвестно.

Для повышения точности редактирования генома в качестве потенциальных терапевтических агентов тестируются другие ферменты. Одними из них являются сайт-специфические никующие эндонуклеазы – ферменты, «узнающие» в ДНК короткую специфическую последовательность, но вносящие разрыв в строго определенном месте только в одну из цепей ДНК.

Исследователи из Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН изучают эти ферменты на протяжении двух последних десятилетий и являются одними из их первооткрывателей. Их коллеги из МГУ сконструировали модифицированные олигонуклеотиды с остатками азобензола и триэтиленгликоля, с помощью которых можно регулировать активность никующих эндонуклеаз.

Эта работа направлена на предотвращение появления неконтролируемых разрывов в ДНК. Химики создали модифицированный короткий двухцепочечный фрагмент ДНК с остатком триэтиленгликоля внутри цепи, содержащий участок, с которым никующая эндонуклеаза связывается, но не может его разрезать. Такой дуплекс блокирует активность фермента. Однако двухцепочечная структура дуплекса стабильна только при комнатной температуре. При нагревании до 45°С цепи ДНК расходятся, и никующая эндонуклеаза высвобождается из комплекса с негидролизуемым аналогом субстрата. Свободный фермент снова способен выполнять свою работу: он специфически разрезает модельную ДНК.

«Наши эксперименты подтвердили доказательство концепции подхода "обратимой молекулярной ловушки" в регуляции активности никующих эндонуклеаз модифицированными олигонуклеотидам», — рассказывает научный сотрудник химического факультета МГУ Людмила Абросимова. — Температура переключения ингибитора ДНК-дуплекса может быть легко настроена путем изменения длины олигонуклеотида, поэтому наша система может быть адаптирована для различных применений».

Авторы работы полагают, что предложенный ими подход будет способствовать разработке новых методов биоанализа и амплификации ДНК с вытеснением цепи, основанных на применении сайт-специфических никующих эндонуклеаз, а также расширит границы применения этих ферментов в редактировании генома.

Работа выполнялась при поддержке грантов РНФ и РФФИ.

Понравился материал? Добавьте Indicator.Ru в «Мои источники» Яндекс.Новостей и читайте нас чаще.

Пресс-релизы о научных исследованиях, информацию о последних вышедших научных статьях и анонсы конференций, а также данные о выигранных грантах и премиях присылайте на адрес science@indicator.ru.