Биология

Гены, ножницы, бумага: за что в 2020 году дали Нобелевскую премию по химии

Как система CRISPR/Cas9 разрезала эпоху ДНК на до и после

Johan Jardestand/The Royal Swedish Academy of Sciences/Alexander Heinl/Indicator.Ru

Для чего бактериям и археям «фотороботы» бактериофага, как нацеливать «генетические ножницы», можно ли из них выбрасывать «детали» и чем они передают «правки» ДНК — Indicator.Ru рассказывает, в чем суть технологии, принесшей химическую Нобелевку этого года

Еще со времен расшифровки структуры ДНК Уотсона и Крика, получивших Нобелевскую премию в 1962 «за открытия в области молекулярной структуры нуклеиновых кислот и за определение их роли для передачи информации в живой материи», ученые всего мира лелеяли мечты переписать генетическую информацию. Только представьте: изменив генетический код, можно вылечить наследственные заболевания, спасти от рака, на новом уровне повелевать клеточными культурами и модифицировать гены будущей еды или другого органического сырья по своему желанию. До недавних пор все это оставалось заманчивой, но далекой и туманной перспективой. Совместить ее с реальностью можно было в рамках узких экспериментов и со множеством оговорок: не все работало на людях, а риск внести случайные нежелательные опечатки в ДНК-инструкции был слишком высок. Настоящим прорывом в генетическом редактировании стала технология CRISPR/Cas9, за развитие которой Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудне присудили Нобелевскую премию по химии 2020 года.

Палиндромы из йогурта

История этого открытия началась в далеком 1987 году, когда впервые была обнаружена необычная повторяющаяся структура в геноме нашей старой знакомой, кишечной палочки Escherichia coli, главной модельной бактерии, которая давно полюбилась экспериментаторам. Пять почти одинаковых последовательностей длиной 29 пар оснований (тех самых «букв» А, У, Г и Ц, которыми в структуре ДНК написан генетический код), в том числе участки из 14 пар оснований, обладающих симметрией второго порядка, между которыми были изменчивые вставки в 32 пары оснований. Годы спустя похожую структуру нашли в геноме археи галофильной (буквально «любящей соль») Haloferax mediterranei, у которой оказалось 14 почти идеально одинаковых участков генома по 30 пар оснований, повторявшиеся через определенный промежуток. Похожие повторы-перевертыши вскоре обнаружились у многих прокариот, или организмов без ядра, и получили название CRISPR (от английского clustered regularly interspaced short palindromic repeats, или «сгруппированные регулярно прерывающиеся короткие палиндромные повторы»). Рядом с ними находились гены специфических белков, которые явно были взаимосвязаны с функционированием этой системы. Все семейство таких белков прозвали Cas, или CRISPR-ассоциированными.

Биологи были заинтригованы: вероятность, что подобные вставки сохранились на столь отдаленных ветвях древа жизни случайно или возникли так много раз независимо, стремилась к нулю. Слишком энергозатратно было бы копировать и передавать потомкам миллиарды лет бесполезный механизм. Если последовательность изменяется медленно (консервативна), значит, это зачем-нибудь нужно. Оставалось выяснить зачем. Хотя интересовало это не всех: компания Danisco, к примеру, ничтоже сумняшеся использовала загадочные последовательности для патентования своих йогуртовых заквасок задолго до того, как функция загадочных палиндромов была расшифрована.

Неожиданным поворотом стало открытие происхождения последовательностей CRISPR: все они оказались копиями, оригиналы который хранились в геномах бактериофагов. И хотя для этих «поработителей» прокариотической жизни важнейшей целью было доставить свой геном в бактерию и заставить ее размножать вирусный наследственный материал, с имеющими CRISPR-фрагменты в своей ДНК бактериями этот трюк не работал. Поэтому 2005 год ознаменовал начало новой эры в генетике: участки CRISPR оказались «молекулярной памятью» о предыдущих нападениях, дающие их носителям… иммунитет. На этот момент уже было известно, что при считывании генетической информации CRISPR превращается в длинную РНК, которая затем разрезается в повторяющихся участках на небольшие кусочки. Появилась гипотеза, что эти кусочки становятся ключом к распознаванию вражеских вирусных фрагментов особой защитной системой, работающей наподобие РНК-интерференции у эукариот (организмов, у которых в клетках есть ядро).

Генетические ножницы в деле

Доказать гипотезу помогли изящные эксперименты, результаты которых были опубликованы в 2007 году. Биологи заразили колонии Streptococcus thermophilus опасными бактериофагами, выделили «выживших» и проанализировали их CRISPR-кассеты. Как и ожидали ученые, стрептококки записали на них «фоторобот преступника» — сохранили вставки из генома бактериофага, который их недавно атаковал. Удаление этих последовательностей или выключение cas-генов лишало бактерии иммунитета, а пронырливые фаги, обзаведясь мутациями в регионе, с которого были скопированы вставки, могли скрываться от бактериального «правосудия».

Предполагаемый механизм работы системы CRISPR, 2009 год

James atmos/Wikimedia Commons

Позже было открыто два класса систем CRISPR. У первого класса Cas-белки собираются в огромный CRISPR-ассоциированный комплекс противовирусной защиты (Cascade — от Cas и complex for antiviral defence), у второго образуется один многодоменный белок Cas9, состоящий из модулей с разными функциями и связывающийся с уже упомянутыми кусочками РНК (crRNA). Как выяснилось в экспериментах на Staphylococci epidermidis, мишенью для систем CRISPR служит первоначальная вирусная ДНК, а не молекула РНК, играющая промежуточную роль в процессе синтеза белка по генетическим ДНК-инструкциям. Фрагменты «вставочной» РНК (спейсеры) Cascade брал «в плен» для опытов, чтобы на их основе распознать ДНК вируса и порубить ее на куски. Более того, бактериальный иммунитет научился не резать собственные вставки вместо соответствующей им вражеской ДНК. Это удается благодаря коротким последовательностям вокруг протоспейсеров, или «будущих вставок», еще не извлеченных из вирусного генома (protospacer adjacent motifs, или PAM). Система CRISPR использует их для «наведения» на свою мишень — не только чтобы уничтожать, но и чтобы добавлять новые вставки в свою коллекцию.

Систему второго класса изучили у Streptococcus thermophilus и Streptococcus pyogenes. В их обороне участвовало четыре белка семейства Cas (и соответствующих им генов, пишущихся с маленькой буквы): кодируемые генами Cas1, Cas2, Csn2 белки занимались приобретением и «монтажом» новых вставок, тогда как без белка с гена Cas5 или Csn1, позднее переименованного в Cas9, не работало разрезание вражеской ДНК.

Сложности взросления и альтер-эго crRNA

Дальше — больше: работая с тем же Streptococcus pyogenes, глава лаборатории молекулярной инфекционной медицины в Университете Умеа (Швеция) Эммануэль Шарпантье в 2011 году выяснила, что с участка на противоположной CRISPR-региону цепи ДНК «выше по последовательности» на 210 пар оснований производилось множество молекул РНК длиной 25 «букв», из которых 24 соответствовали повторяющемуся участку CRISPR-региона. По правилу комплементарности (связей между парными «буквами», которые и держат две цепи ДНК вместе) такая РНК должна была связываться с незрелой криспр-РНК (crRNA). Шарпантье увидела, что при удалении участка, где новая РНК была закодирована, как и без белка Cas9, криспр-РНК не достигает «взрослого», рабочего состояния. Она выдвинула гипотезу, что Cas9 становится якорем, помогающим незрелой криспр-РНК связаться с ее «альтер-эго», которую назвали транс-активирующей криспр-РНК, и только вдвоем эти две молекулы РНК сможет узнать белок, который помогает ее «взрослению», разрезая ее на кусочки.

Но может ли криспр-РНК использоваться для наведения режущего белка на нужные нам последовательности? С этого вопроса началось судьбоносное сотрудничество между Шарпантье и Дженнифер Дудной, профессором биохимии и молекулярной биологии в Калифорнийском университете Беркли. Вместе они изучили две важные функции транс-активирующей криспр-РНК: запуск созревания криспр-РНК и активирование работы Cas9-ножниц, разрезающих вражескую ДНК, похожую на криспр-РНК фрагменты. Они исследовали процесс более подробно. Разрез происходил очень точно, на три пары оснований «выше» PAM-последовательности, но мутации в этом мотиве нарушали слаженный процесс, только если речь шла о двуцепочечной ДНК. Когда цепь была одна, мутации в PAM (как мы помним, нужном системе наведения) роли не играли. Это означало, что тот был необходим, чтобы расплетать двуцепочечную спираль. При этом Cas9 работал как двойные ножницы, где каждый домен резал свою цепочку ДНК, хотя и в соответствующих друг другу (и вставкам из картотеки криспр-РНК) местах.

Они определили на криспр-РНК и транс-активирующей криспр-РНК рядом с PAM по небольшому участку, которые были совершенно необходимы для работы ножниц Cas9. Соединив такие незаменимые фрагменты, Дудна и Шарпантье задумали создать химерную одиночную направляющую РНК — проводника с непререкаемым авторитетом, которому Cas9 должен повиноваться в выборе участков для разрезания. Эксперименты подтвердили, что такая конструкция возможна. Таким образом, в руках ученых оказался фермент из двух компонентов, Cas9 и одиночной направляющей РНК. Второй компонент можно было менять, делая мишенью ножниц любые фрагменты ДНК по своему усмотрению, а единственным ограничением была последовательность PAM, без которой двойную спираль было не распутать. «Наша работа описывает семейство эндонуклеаз (режущих ДНК ферментов — прим. Indicator.Ru), которые используют двойную РНК для разрезания ДНК в специфических местах, и отмечает возможность применения систем для РНК-программируемого геномного редактирования», — за такой скромной и замысловатой формулировкой авторов скрывалась прорывная технология с невероятными перспективами.

Дорогая редакция

Уже в начале 2013 года появились первые экспериментальные подтверждения, что CRISPR/Cas9 породила жизнеспособную технологию, которая работала и в дрожжах, и у дрозофил, и у круглых червей Caenorhabditis elegans, и у рыбок данио-рерио, и у резуховидки Таля. Удалось получить варианты Cas9 с другими требованиями к PAM, а также заставить комплекс Cas вслед за криспр-РНК нападать на мРНК противника — не уничтожать «ген-оригинал», но и белок с него не давать синтезировать.

Еще один элегантный метод первичного редактирования и вовсе позволил заменять неугодный участок ДНК на другой. Он работает на основе Cas9-никазы, то есть ножниц, режущих только одну из цепей ДНК (для этого домен, отвечающий за вторую цепь, инактивируется). При этом одиночная направляющая РНК не только ведет ножницы к цели, но и содержит дополнительный кусочек инструкций — образец для исправлений. К никазе Cas9 присоединяется обратная транскриптаза — вирусный фермент, который позволяет «переводить» буквы РНК в ДНК (обычно в клетках все происходит наоборот). В итоге ножницы нового типа производят один высокоточный разрез в нужном месте и контролируют подмену одного фрагмента на другой (иногда даже одной буквы на другую).

При помощи ножниц Cas9 и биоинженерной одиночной направляющей РНК ученые могут узнавать о функциях генов, исследовать мутации и их сочетания, модифицировать культурные растения, лечить серповидноклеточную анемию, β-талассемию и другие наследственные заболевания. Но с большой силой приходит большая ответственность: CRISPR/Cas9 заставляет по-новому взглянуть на этические, социальные и другие последствия редактирования генома. Первые пациенты уже здоровы, но насколько широко эта технология распространится в медицине, мы пока не знаем. Ясно только одно: самые головокружительные возможности еще впереди, скучно точно не будет.

Понравился материал? Добавьте Indicator.Ru в «Мои источники» Яндекс.Новостей и читайте нас чаще.

Подписывайтесь на Indicator.Ru в соцсетях: Facebook, ВКонтакте, Twitter, Telegram, Одноклассники.